4D新时代！更精确的磷酸化修饰组学
景杰学术/报道
离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D蛋白质组学是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离（图1），并大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。
图1. 新一代4D蛋白质组学示意图
磷酸化是研究最广泛的翻译后修饰类型，在生长发育、信号转导以及包括癌症在内的各种疾病进程中都发挥着至关重要的作用。而随着科学的逐渐深入和技术的不断进步，基于质谱的磷酸化修饰组学也引起了人们越来越多的关注，并有力推动了磷酸化功能研究的进展。
然而对于传统的质谱技术来说，要想实现磷酸化的深度和精确鉴定存在着两大挑战，1）生物样品中不同的磷酸化肽段丰度会呈现出几个数量级的差异，这需要更高的质谱扫描速度和灵敏度来鉴定到低丰度的磷酸化肽段；2）同一个肽段发生磷酸化位点的不同，会造成同分异构的磷酸化肽段，并且这些同分异构的磷酸化肽段大部分会在色谱上共洗脱，而传统蛋白组学质谱平台不能对这些共洗脱的同分异构肽段进行分离。
现在得益于质谱技术的进步，采用基于Bruker timsTOF Pro平台的4D蛋白质组学技术，这两大问题都得到极大的改善，除了在蛋白质组分析方面展现出的极佳的灵敏度和覆盖深度，根据我们最近的测试结果，其在磷酸化修饰分析上更加展现出了强大的优势（图2）。在检测深度方面，能够高效快速地从不同细胞组织中平均鉴定到8000-10000个高可信度的磷酸化修饰位点（localization probability>0.75），相比传统技术提升50%以上。
图2. A. timsTOF Pro的高速扫描循环；B. 4D磷酸化技术鉴定磷酸化位点的数目
除了检测深度和效率，磷酸化组分析的另一大难题是同分异构现象：例如图3中的两个同分异构体的磷酸化肽段，分子序列完全一样，只是发生磷酸化的位置不同，这些同分异构的磷酸化肽段在一级谱图上的质量完全相同，而在二级谱图上也高度类似。面对这样微小的差别，传统的质谱鉴定和搜库软件通常难以做明确的区分，极易导致出现错误定位（false localization）的问题。为限制错误定位的情况，目前主要是通过多种评估软件或算法来进行打分和筛选，但这些统计的方法并没有在质谱鉴定水平上解决修饰位点准确定位的问题，只能够识别出错误的位点，但不能让这些位点被正确的检出。
图3. 磷酸化肽段的同分异构
更为令人担忧的是，这种同分异构的现象不但棘手，而且其存在是相当普遍的。根据大规模的分析测试结果，估计至少26%的磷酸化肽段存在同分异构的现象，且其中50%的同分异构体在色谱上无法做到有效的区分（图4B）。对于这些修饰肽段信号的精确识别，传统的方法技术则显得束手无策。
图4. 同分异构磷酸修饰肽段比例以及在不同保留时间的分布
现在，这些问题终于有了根本上的解决方案。新一代的4D蛋白质组学除了在蛋白鉴定上有着卓越的性能，新增的离子淌度分离还能解决同分异构的问题，使得PTMs的鉴定更加可靠。 很多磷酸化肽段的同分异构体其洗脱时间和质荷比完全一样，但是由于发生磷酸化的位置不同，所以在结构上会有差别，在经过4D蛋白质组学的离子淌度分离就会被有效地分离开来。离子淌度和HPLC两个层面的联合分离，能够最大程度地区分和识别这些共洗脱的修饰肽段信号。
在图5最新的测试数据中我们可以看到，5号和6号是两个共洗脱的同分异构磷酸化肽段，质荷比相同，色谱又不能分离，但是通过离子淌度可以很好的分离鉴定。同时，6号和7号肽段虽然质荷比一致，离子淌度值（1/k0）也比较接近，但可以通过保留时间进行区分。表中的7个磷酸化肽段，如果只依赖于质荷比和保留时间，只有能对其中2个进行精确定量，但如果再结合离子淌度信息，可对其中的5个进行精确定量分析。
通过以上的介绍我们发现，4D蛋白质组学除了在蛋白质组分析方面展现出的极佳的灵敏度和覆盖深度以外，还能够带来更精确的磷酸化修饰的鉴定与定量分析，大幅度提高翻译后修饰位点定位和定量的可靠性，再次展现了4D蛋白质组学强大的功能和广泛的应用前景。
参考文献：
1． Heiner Koch，et al., The PASEF method on a TIMS-QTOF mass spectrometer for High Sensitivity Phosphoproteomics. ASMS 2018, TP 555
2． Christopher M. Adams, et al., Identification and Quantitation of Phosphopeptide Positional Isomers using Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF. ASMS 2019, WP 662
长按扫描二维码↓↓，了解更多【人工客服】、【项目查询】、及其他方法案例干货。
往期精彩回顾
TimsTOF Pro：景杰生物引进全球顶尖质谱仪timsTOF Pro
4D-LFQ：重磅！Matthias Mann发文，基于捕获离子淌度的新一代4D 蛋白质组学
第01课：投稿建议：写完文章往哪投？蛋白组学领域期刊介绍与投稿建议
第02课：上传组学数据：投稿前你需要知道的一件小事，如何上传组学原始数据？
第03课：制作火山图：简单两步，用Excel轻松搞定火山图
第04课：蛋白互作网络图：手把手教你做蛋白互作网络图
第05课：画韦恩图：教你轻松画韦恩图
全国巡讲点击预约：PTM BIO蛋白质组学与翻译后修饰2019全国巡讲，点击预约！